生物化学实验教程（第三版）pdf/txt下载_在线阅读全文

编辑推荐

《生物化学实验教程》的实验方法严谨可靠，可操作性强，可供高等师范院校生命科学专业学生使用，也可供非师范院校相关专业学生、生命科学研究工作者和中学生物学教师参考。

内容简介

《生物化学实验教程》比较系统、全面地介绍了生物化学常用实验技术与方法。《生物化学实验教程》共分为三部分，第一部分为基础性实验，介绍生物化学实验的基本原理和技术。第二部分为综合性实验，主要介绍蛋白质的纯化和鉴定及部分分子生物学实验技术。这两部分内容涵盖蛋白质、核酸、酶、维生素、糖、脂、激素的分离、制备、性质功能及定性和定量分析技术，包括层析法、分光光度法、电泳法、离心分离法及物质代谢研究法等。第三部分为研究性实验，以培养学生独立科研能力为主要目的。

目　　录

第三版前言
第一部分基础性实验
实验1 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 (2)
实验2 凝胶层析法使蛋白质脱盐 (3)
实验3 蛋白质的沉淀与透析 (6)
实验4 膜分离技术——离心超滤法纯化和浓缩蛋白质 (8)
实验5 微量凯氏(Micro Kjeldahl)定氮法测定蛋白质含量 (10)
实验6 利用分光光度计测定双缩脲反应的有色产物吸收光谱 (14)
实验7 BCA法测定蛋白质含量 (16)
实验8 考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量 (18)
实验9 紫外吸收法测定蛋白质含量 (20)
实验10 乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白 (22)
实验11 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离血清蛋白 (25)
实验12 酶的特异性 (29)

第三版前言 
第一部分 基础性实验 
实验1 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 (2) 
实验2 凝胶层析法使蛋白质脱盐 (3) 
实验3 蛋白质的沉淀与透析 (6) 
实验4 膜分离技术——离心超滤法纯化和浓缩蛋白质 (8) 
实验5 微量凯氏(Micro Kjeldahl)定氮法测定蛋白质含量 (10) 
实验6 利用分光光度计测定双缩脲反应的有色产物吸收光谱 (14) 
实验7 BCA法测定蛋白质含量 (16) 
实验8 考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量 (18) 
实验9 紫外吸收法测定蛋白质含量 (20) 
实验10 乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白 (22) 
实验11 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离血清蛋白 (25) 
实验12 酶的特异性 (29) 
实验13 酶促反应动力学——pH、温度、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响 (31) 
实验14 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 (35) 
实验15 脲酶犓m 值的测定 (36) 
实验16 过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及鉴定 (39) 
实验17 酵母RNA的提取与组分鉴定 (42) 
实验18 动物肝脏DNA的提取与检测 (44) 
实验19 RNA定量测定——改良苔黑酚法 (46) 
实验20 核酸的定量测定——紫外分光光度法 (48) 
实验21 乙酸纤维素薄膜电泳分离核苷酸 (50) 
实验22 维生素C的定量测定——2，6 二氯酚靛酚滴定法 (52) 
实验23 还原糖的测定——3，5 二硝基水杨酸(DNS)比色法 (54) 
实验24 血糖含量的测定(Folin Wu法) (56) 
实验25 植物组织中可溶性糖含量的测定(蒽酮法) (58) 
实验26 饱食、饥饿、肾上腺素、胰岛素对肝糖原含量的影响 (60) 
实验27 小麦萌发前后淀粉酶活性的比较 (62) 
实验28 脂肪酸的β 氧化 (64) 
实验29 血清中谷丙转氨酶活性的测定 (67) 
第二部分 综合性实验 
实验30 细胞色素C的提取制备与含量测定 (70) 
实验31 凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量 (73) 
实验32 质粒的提取、酶切与电泳分析 (77) 
实验33 聚合酶链反应 (81) 
实验34 蛋白质印迹(Western Blotting) (84) 
第三部分 研究性实验 
实验35 转基因植物的PCR鉴定 (92) 
实验36 植物热激蛋白的Western blotting分析 (93) 
实验37 读码框架影响融合蛋白表达正确性 (94) 
附录一 实验报告范例 (96) 
附录二 生物化学实验常用参考数据 (101) 
主要参考文献 (108)

显示全部信息

在线试读部分章节

第一部分基础性实验
实验1 氨基酸的分离鉴定——纸层析法
【实验目的】
1.学习氨基酸纸层析法的基本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
【实验原理】
纸层析法(paperchromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2~3cm 的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数(犓d)不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值(rateofflow，Rf)来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点(又称为层析点)中心的距离(X)与原点至溶剂前沿的距离(Y)的比值(图1-1):
在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
【器材与试剂】
1.器材
层析缸(或标本缸)、点样毛细管(或棉棒)、小烧杯、培养皿、量筒、喉头喷雾器、吹风机(或烘箱)、层析滤纸(新华一号)、直尺及铅笔。
2.试剂
(1)扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液):将正丁醇、乙酸和水以体积比4∶1∶1混合，充分振荡。
(2)氨基酸溶液:0.5%(m/V)组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液[各组分均为(0.5%)]。
(3)显色剂:0.1%(m/V)水合茚三酮正丁醇溶液。

第一部分 基础性实验 
实验1 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 
【实验目的】 
1.学习氨基酸纸层析法的基本原理。 
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。 
【实验原理】 
纸层析法(paperchromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2~3cm 的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数(犓d)不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值(rateofflow，Rf)来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点(又称为层析点)中心的距离(X)与原点至溶剂前沿的距离(Y)的比值(图1-1): 
在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。 
【器材与试剂】 
1.器材 
层析缸(或标本缸)、点样毛细管(或棉棒)、小烧杯、培养皿、量筒、喉头喷雾器、吹风机(或烘箱)、层析滤纸(新华一号)、直尺及铅笔。 
2.试剂 
(1)扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液):将正丁醇、乙酸和水以体积比4∶1∶1混合，充分振荡。 
(2)氨基酸溶液:0.5%(m/V)组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液[各组分均为(0.5%)]。 
(3)显色剂:0.1%(m/V)水合茚三酮正丁醇溶液。 
【实验步骤】 
1.准备滤纸 
取层析滤纸(长18cm、宽15cm)一张，在纸的一端距边缘2cm 处用铅笔划一条直线，在此直线上做5个等距离点，如图1 1所示。 
2.点样 
用毛细管将各氨基酸样品分别点在这5个位置上，干后重复点样2~3次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。 
3.扩展 
用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm)。待溶剂上升10~12cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机冷风吹干。 
4.显色 
用喷雾器均匀喷上0.1%水合茚三酮正丁醇溶液，然后用吹风机热风吹干或者置烘箱中(100℃)烘烤5min即可显出各层析斑点。 
5.计算 
用直尺测量并计算出各标准氨基酸的Rf 值，同时计算出混合氨基酸的四个层析斑点的Rf 值。通过与标准氨基酸比较，确定混合氨基酸中各氨基酸在滤纸上的位置。 
【要点提示】 
1.取滤纸前，要将手洗净，因为手上的汗渍会污染滤纸，并尽可能少接触滤纸；如条件许可，也可戴上一次性手套拿滤纸。要将滤纸平放在洁净的纸上，不可放在实验台上，以防止污染。 
2.点样点的直径不能大于0.5cm，否则分离效果不好，并且样品用量大，会造成“拖尾巴”现象。 
3.在滤纸的一端用点样器点上样品，点样点(原点)要高于培养皿中扩展剂液面约1cm。由于各氨基酸在流动相(有机溶剂)和固定相(滤纸吸附的水)的分配系数不同，当扩展剂从滤纸一端向另一端展开时，对样品中各组分进行了连续的抽提，从而使混合物中的各组分分离。 
【思考题】 
1.纸层析法的原理是什么? 
2.何谓Rf 值?影响Rf 值的主要因素是什么? 
实验2 凝胶层析法使蛋白质脱盐 
【实验目的】 
学习凝胶层析法分离纯化物质的原理与操作技术。 
【实验原理】 
凝胶层析也称凝胶过滤，其分离纯化物质的原理是:凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质被排阻在外部，当一混合溶液通过凝胶层析柱时，溶液中的物质就按不同相对分子质量被分开了。凝胶层析过程中一般不变换洗脱液，具有设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等优点。所以，此法除了常用于分离纯化蛋白质(包括酶类)、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质外，还可用于测定蛋白质的相对分子质量、样品的浓缩和脱盐等方面。目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶，其中最常用的是葡聚糖凝胶。 
葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，它是葡萄糖通过α 1，6 糖苷键形成的葡聚糖长链，与交联剂环氧氯丙烷以醚键相互交联而成的具有三维空间的多孔网状结构物(图1 2)，呈珠状颗粒。 
图1 2 葡聚糖凝胶的多孔网状结构示意图 
在合成凝胶时，控制环氧氯丙烷的用量，可以制成网孔大小不同的葡聚糖凝胶，即不同规格的凝胶。葡聚糖凝胶从G 10到G 200有多种类型。G 后的数字代表每克干胶充分溶胀后吸水的克数乘以10，也反映了凝胶网孔的相对大小，G 后的数字越小，其溶胀后的网孔越小。一般G 10到G 50适用于蛋白质与小分子或无机盐的分离，G 75到G 200适用于分子质量大于10000Da的蛋白质的相互分离。 
蛋白质溶液中如含有无机盐离子，用葡聚糖凝胶层析法可使蛋白质与无机盐分离，效果理想。本实验用G 25使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的(NH4)2SO4扩散进入G 25的网孔中，而大分子的蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻在凝胶颗粒(固定相)的外面。加入洗脱液(流动相)洗脱时，因大分子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动，首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可以扩散进凝胶颗粒的网孔之中，在层析柱中移动较慢，需要较大的洗脱体积才能从柱中洗出，这样蛋白质与(NH4)2SO4很容易地被分离开，从而达到对蛋白质样品脱盐的目的(图1 3)。 
【器材与试剂】 
1.器材 
铁架台、层析柱(11mm×300mm)、滴定管夹、1mL刻度滴管、刻度试管、白瓷板、SephadexG 25(粒度粗50~100目)、细乳胶管、螺旋夹、弹簧夹、烧杯。 
2.试剂 
(1)10%(m/V)磺柳酸溶液 
(2)奈氏(Nessler)试剂:将HgI211.5g及KI8g溶于去离子水中，稀释至50mL，加入6mol/LNaOH50mL，静止后取上清液储存于棕色瓶中。 
(3)蛋白质(NH4)2SO4溶液:实验前配制含0.25%(m/V)牛血清清蛋白、0.1%(m/V)(NH4)2SO4和10%(m/V)蔗糖的混合溶液。 
(4)去离子水(洗脱液) 
【实验步骤】 
1.溶胀凝胶 
用去离子水浸泡SephadexG 25凝胶24h以上(中间换一次水)或用去离子水沸水浴溶胀2h左右。 
2.凝胶装柱 
将层析柱固定在铁架台上，两端分别连接乳胶管。上端与洗脱液连通，装一螺旋夹用于调控洗脱速度。先用少量洗脱液洗柱并排除乳胶管中的气泡，待柱中洗脱液高度约2cm 时，关闭下端开关式弹簧夹。 
将溶胀好的SephadexG 25倒入层析柱中，使其自然沉降，沉降后凝胶柱的高度为层析柱的3/4~4/5且柱床面平整比较理想。打开下端开口，排除多余的洗脱液，床面上维持约2cm 高的洗脱液，再关闭下口。 
3.洗柱 
通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层析柱接通，然后打开下端开口，让洗脱液滴下冲洗层析柱，以除去杂质并使柱床均匀密实(此步也称作平衡)。适当时间后(流下的洗脱液体积一般为柱床体积的2~3倍)，再关闭下口。洗柱过程中注意调整流速约2mL/min。 
4.加样洗脱 
用刻度滴管吸取1mL样品[蛋白质(NH4)2SO4 溶液]，其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面之上，慢慢将样品加到凝胶床面上(不可搅动床面)，此时能看到床面上样品与洗脱液之间有一清晰界面。打开下端开口，待样品全部进入凝胶柱中，接通洗脱液，开始洗脱并收集洗脱液。 
5.收集检查 
用刻度试管收集洗脱液，每管收集1mL。边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。 
 铵盐检查:从每管中取收集液2滴置白瓷板穴中，加入奈氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉淀，以“+”的多少表示每穴中出现沉淀的程度。 
 蛋白质检查:向每管剩余的收集液中加入磺柳酸溶液5滴，振荡，如有蛋白质洗脱下来，则出现白色浑浊或沉淀，以“+”的多少表示不同收集管中沉淀的程度。 
分析蛋白质和铵盐洗脱的次序，并做出合理解释。 
【要点提示】 
1.装柱时，凝胶中的水不宜过多，用玻棒搅动小烧杯中的凝胶，一次将柱加满，凝胶自然下沉后，凝胶的高度应以层析柱长度的3/4~4/5为宜。如果层析柱中凝胶高度不够，应在凝胶床面未形成之前再加入葡聚糖凝胶，要尽量防止由于加胶次数较多，胶中出现节痕。同时，要注意避免柱床内产生气泡。 
2.加入样品时应十分注意不要搅动床面，不要使样品与床面上的洗脱液混合，否则影响分离效果。 
3.如果层析柱的口径和长度较大，可适当增加收集管的数量。 
【思考题】 
1.蛋白质溶液中的盐分为何能通过凝胶层析法被去除? 
2.凝胶层析法在蛋白质分析中还有何应用? 
实验3 蛋白质的沉淀与透析 
【实验目的】 
1.学习蛋白质沉淀和透析的基本原理。 
2.掌握蛋白质的可逆沉淀及透析的基本操作技术。 
【实验原理】 
多数蛋白质是亲水胶体，凡是能破坏水化膜和能中和表面电荷的因素或物质均可导

显示全部信息

生物化学实验教程（第三版）下载

生物化学实验教程（第三版）

发布书评

相关图书推荐