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《医学生物化学与分子生物学实验教程》适合医药院校本科生及研究生使用。

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医学生物化学与分子生物学实验教程适合医药院校本科生及研究生使用。

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目　　录

目　　录第一篇　概　　论
第一章　实验室基本常识 (1)第二章　生物化学实验基本操作 (5)
第二篇　常用技术
第一章　分光分析技术 (9)第二章　电泳技术 (13)第三章　层析技术 (27)第四章　离心技术 (35)第五章　聚合酶链反应技术 (39)第六章　印迹技术 (43)第七章　组织细胞培养技术 (48)
第三篇　生物化学实验
实验一　蛋白质定量测定 (64)实验二　蛋白质的沉淀反应 (74)实验三　蛋白质的两性反应和等电点测定 (75)实验四　血清蛋白乙酸纤维素薄膜电泳 (77)实验五　聚丙烯酰胺凝胶电泳 (79)实验六　肝染色质蛋白的提取与鉴定 (85)实验七　凝胶层析法分离血红蛋白与 DNP-酪蛋白 (87)实验八　 DEAE-纤维素离子交换层析分离血清蛋白质 (89)实验九　亲和层析法分离乳酸脱氢酶 (91)实验十　影响酶活性的因素 (95)实验十一　碱性磷酸酶 Km值测定 (97)实验十二　底物浓度及抑制剂对酶活性的影响 (99)实验十三　琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 (101)实验十四　乳酸脱氢酶同工酶的测定 (103)实验十五　血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT)的测定 (105)实验十六　转氨基作用 (109)实验十七　血糖测定及胰岛素和肾上腺素对血糖浓度的影响 (110)实验十八　糖酵解中间产物的鉴定 (116)实验十九　血清胆固醇总量的测定 (119)实验二十　血清尿素氮测定 (122)实验二十一　酮体的生成与利用 (125)
实验二十二　血清 (浆)过氧化脂质测定 (128)第四篇　分子生物学实验

目　　录第一篇　概　　论 第一章　实验室基本常识 	 (1)第二章　生物化学实验基本操作 	 (5) 第二篇　常用技术 第一章　分光分析技术 	 (9)第二章　电泳技术 	 (13)第三章　层析技术 	 (27)第四章　离心技术 	 (35)第五章　聚合酶链反应技术 	 (39)第六章　印迹技术 	 (43)第七章　组织细胞培养技术 	 (48) 第三篇　生物化学实验 实验一　蛋白质定量测定 	 (64)实验二　蛋白质的沉淀反应 	 (74)实验三　蛋白质的两性反应和等电点测定 	 (75)实验四　血清蛋白乙酸纤维素薄膜电泳 	 (77)实验五　聚丙烯酰胺凝胶电泳 	 (79)实验六　肝染色质蛋白的提取与鉴定 	 (85)实验七　凝胶层析法分离血红蛋白与 DNP-酪蛋白 	 (87)实验八　 DEAE-纤维素离子交换层析分离血清蛋白质 	 (89)实验九　亲和层析法分离乳酸脱氢酶 	 (91)实验十　影响酶活性的因素 	 (95)实验十一　碱性磷酸酶 Km值测定 	 (97)实验十二　底物浓度及抑制剂对酶活性的影响 	 (99)实验十三　琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 	 (101)实验十四　乳酸脱氢酶同工酶的测定 	 (103)实验十五　血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT)的测定 	 (105)实验十六　转氨基作用 	 (109)实验十七　血糖测定及胰岛素和肾上腺素对血糖浓度的影响 	 (110)实验十八　糖酵解中间产物的鉴定 	 (116)实验十九　血清胆固醇总量的测定 	 (119)实验二十　血清尿素氮测定 	 (122)实验二十一　酮体的生成与利用 	 (125) 实验二十二　血清 (浆)过氧化脂质测定 	 (128)第四篇　分子生物学实验 实验一　酵母 RNA的提取与成分鉴定 	 (133)实验二　真核细胞 DNA的提取与鉴定 	 (134)实验三　基因的 PCR扩增与产物鉴定 	 (139)实验四　肉制品的基因鉴定 	 (142)实验五　人 p16基因 PCR扩增产物的 T/A克隆 	 (145)实验六　大肠杆菌感受态细胞的制备 	 (146)实验七　质粒热激法转化感受态细菌 	 (149)实验八　重组克隆的筛选与扩增 	 (151)实验九　转化菌的质粒提取与定量 	 (153)实验十　质粒的酶切与琼脂糖凝胶电泳鉴定 	 (156)实验十一　pcDNA3． 1( +)-EGFP质粒转染 HeLa细胞株 	 (161)实验十二　pcDNA3． 1( +)-EGFP质粒转染 HeLa细胞株的 RT-PCR分析 	 (162)实验十三　pcDNA3． 1( +)-EGFP质粒转染 HeLa细胞株的 Western分析 	 (165)实验十四　 PCR-RFLP检测 NQO1 C609T多态性 	 (171)实验十五　检测人 CLEC4M基因多态性 	 (174) 附录 	 (177)　一、常用缓冲液及酸碱指示剂的配制方法 	 (177)　二、化学试剂的规格及保管 	 (181)　三、几种动物生化常数 	 (183)　四、聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配制　 	 (185)　五、细胞培养用液的配制 	 (186)　六、生物化学与分子生物学实验常用词的中英文对照 	 (190)

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前　　言

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第一篇　概　　论
第一章　实验室基本常识
一、实验须知
　　生物化学与分子生物学既是生命科学的基础学科又是生命科学的前沿学科 ,在基础医学和临床医学中占据着举足轻重的地位 ,是医学专业课的基础之基础。因此 ,随着近代医学的发展 ,越来越多地将生物化学的理论与技术 ,应用于疾病的预防、诊断和治疗 ,从分子水平探讨各种疾病发生发展的机制 ,已成为当代医学研究的共同目标。随着生物化学与分子生物学的进一步发展 ,将给临床医学的诊断和治疗带来全新的理念 ,而生物化学与分子生物学这门实验技术显得尤为重要。生物化学与分子生物学实验课的重要环节 ,是通过实验过程中所反应的现象 ,联系并加深对理论内容的理解 ,掌握生化与分子生物学基本操作、实验原理和一般仪器的使用 ,培养科学实验技能和严谨的科学态度。同时 ,通过准确记录 ,科学分析及实事求是的书写实验报告 ,培养学生的科学思维、分析判断和解决实际问题的能力 ,对形成尊重科学事实和真理的学风具有重要意义。
(一)生物化学实验的目的
1．
通过实验让学生掌握基本的生物化学实验操作及技能。
2．
通过实验使学生加深对生物化学理论知识的理解。
3．
培养学生分析问题和解决问题的能力 ,以及创新求实的工作作风。
(二)实验室规则及常识
1．
严格遵守实验课纪律 ,不迟到 ,不早退。必须穿白大衣进入实验室。
2．不得高声说话

第一篇　概　　论 第一章　实验室基本常识 一、实验须知 　　生物化学与分子生物学既是生命科学的基础学科又是生命科学的前沿学科 ,在基础医学和临床医学中占据着举足轻重的地位 ,是医学专业课的基础之基础。因此 ,随着近代医学的发展 ,越来越多地将生物化学的理论与技术 ,应用于疾病的预防、诊断和治疗 ,从分子水平探讨各种疾病发生发展的机制 ,已成为当代医学研究的共同目标。随着生物化学与分子生物学的进一步发展 ,将给临床医学的诊断和治疗带来全新的理念 ,而生物化学与分子生物学这门实验技术显得尤为重要。生物化学与分子生物学实验课的重要环节 ,是通过实验过程中所反应的现象 ,联系并加深对理论内容的理解 ,掌握生化与分子生物学基本操作、实验原理和一般仪器的使用 ,培养科学实验技能和严谨的科学态度。同时 ,通过准确记录 ,科学分析及实事求是的书写实验报告 ,培养学生的科学思维、分析判断和解决实际问题的能力 ,对形成尊重科学事实和真理的学风具有重要意义。 (一)生物化学实验的目的 1． 通过实验让学生掌握基本的生物化学实验操作及技能。 2． 通过实验使学生加深对生物化学理论知识的理解。 3． 培养学生分析问题和解决问题的能力 ,以及创新求实的工作作风。 (二)实验室规则及常识 1． 严格遵守实验课纪律 ,不迟到 ,不早退。必须穿白大衣进入实验室。 2．不得高声说话 ,严禁用器械及动物开玩笑。 3．取用试剂时必须 “盖随瓶走 ”,用后立即盖好放回原处 ,切忌 “张冠李戴”。 4． 标准试剂必须用清洁干燥吸管取出 ,取出后不得放入原瓶。 5．爱护公物 ,节约水、电、试剂 ,遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 6．严格按操作规程使用仪器 ,凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用。对贵重仪器必须先熟知使用方法 ,才能开始使用。仪器发生故障 ,应立即关闭电源并报告老师 ,不得擅自 拆修7．。实验完毕 ,将有关仪器和器材洗净归置好 ,值日生负责整个实验室的清洁和整理 ,保持实验室整洁。 8．舍弃物必须依照其性质作适当的处理 ,以免造成实验污物损坏或污染实验室环境。 (三)生物化学实验课的要求 1．课前要充分预习实验课的有关内容 ,明确实验目的、原理、操作步骤及注意事项等 , 写出预习报告。 2． 实验过程中不做与实验无关的事情 ,不妨碍他人实验。 3． 加强基本技术训练 ,如移液、混匀、过滤等。 4． 熟悉常用仪器的使用方法 ,如分光光度计、离心机、电泳仪等。 5．以实事求是的科学态度如实记录实验结果 ,仔细分析 ,做出客观结论。实验失败 ,须认真查找原因 ,不得任意涂改实验结果。 6．及时写好实验报告并按时上交。 二、实验记录及实验报告的书写 获得了准确的实验结果还不是实验的结束 ,实验室工作的目的是用一种简单易懂的方式向他人传播实验结果和所引出的概念 ,书写实验报告是更严格地撰写科学论文的基础和极好的练习机会。书写实验报告最好用实验报告本 ,也可以用实验报告纸 ,但为避免遗失 ,实验课全部结束后应装订成册 ,以便保存。书写实验报告应包括下列内容。 1．标题 　课程和实验名称、实验者姓名、实验日期等都写在实验报告上。表示2．。目的和原理　简明扼要地概括出实验的目的、原理 ,涉及化学反应的最好用反应式 3．方法步骤 　列出简要明了的操作步骤 ,以便自己将来或他人能够重复 ,尽量用流程图或表格表示。 4．记录 　实验记录应及时、准确详尽、真实、清楚。及时是指在实验中观察到的现象、数据要马上记录在记录本 (或“实验指导 ”的合适位置)上,回顾性记录易造成无意或有意的失真。 准确详尽记录实验中观察到的实验现象 ,而不是照抄实验书上所列应观察到的实验结果,记录实验现象的所有细节。如报告一个特殊实验中生成一种黄色沉淀是不够的 ,要写明在什么条件下 (比如加热到什么温度、保温多长时间)、什么时候 (快速还是缓慢)、生成多少、什么形状 (胶状还是絮状或是颗粒状)、什么颜色 (亮黄、橘黄或是其他 )的沉淀。在科学研究中仔细观察 ,特别注意未预期的实验现象是十分重要的 ,这些观察常常引起意外的发现,而且为了重复工作也需要准确的实验报告。使用精密仪器进行实验时 ,需在仪器登记册上及时记录仪器的型号及编号。 现象及数据的记录必须真实 ,不可掺杂任何主观因素 ,切忌拼凑实验数据、结果。对于 “不正常 ”的现象和数据更应如实记录 ,并分析查找原因。现象及数据的记录可以与操作步骤的表格合在一起。实验记录不能用铅笔 ,须用钢笔或圆珠笔记录清楚 ,不要擦抹及修改 ,但可以划去重写。 5． 数据处理及结果分析　根据实验要求 ,整理、归纳数据后进行计算得出结果 ,包括根据实验数据及计算结果作出的各种图表 (如曲线图、对照表等 )及从图表得出的结果。 6．讨论 　讨论部分不是对结果的重述 ,而是对实验结果、实验方法和实验异常结果的分析和探讨 ,以及对实验设计的认识、体会及建议。 7．结论　结论要简明扼要 ,以说明本次实验所获得的结果并加以叙述验证本次实验 原理8．。怎样画图　在许多实验中都有一个量 ,如浓度、pH或温度 ,在系统地变化着 ,要测量的是此量对另一量的影响。已知量叫做自变量 ,未知量叫做应变量。画图时 ,习惯把自变量画在横轴上 ,而把应变量画在纵轴上。下面列出一些作图的提示。 (1)每图应有简洁的标题 ,清楚地标明两个轴的名称及计量单位。 (2)两轴均要标明刻度标记 ,选用合适的单位 ,使轴上数字不要太大 ,且最好用简单数字标明轴上的标度。如使用 10mmol / L就比0． 01mol / L和 10 000μmol / L要好。 (3)为了清楚起见 ,调整标度使斜度约为45°。 (4) 尽可能使各点间距离相等 ,不要使各点挤在一起或距离太大。 (5) 根据不同的实验用光滑连续的曲线或直线连接各点。 (6) 若同一张图上有两条以上曲线 ,应用不同的符号分别标明相应的测定点。 三、实验误差与提高实验准确度的方法 生物科学研究中常需要对组成生物体的几类主要化学物质如糖、脂肪、蛋白质、核酸、维生素、酶等进行定量测定。由于受分析方法、测量仪器、所用试剂和分析工作者等方面的限制,测量值与客观存在的真实值很难完全一致 ,即所有的测量都可能产生误差。了解这些误差的可能来源 ,才能尽量减少误差、提高实验准确度。根据误差的性质和来源 ,一般将误差分为系统误差和偶然误差两类。 (一)系统误差及减少的方法 1．系统误差　系统误差是在测定过程中由某些经常发生的原因所造成的。它对测定结果的影响比较稳定 ,在同一条件下重复测定中常重复出现 ,使测定结果不是偏高就是偏低,而且大小有一定规律 ,它的大小与正负往往可以测定出来 ,至少从理论上来说是可以测定的 ,故又称可测误差。主要有以下 4个方面的来源 : (1)方法误差 :由采用的分析方法本身造成。如重量分析中沉淀物沉淀不完全或洗涤过程中少量溶解 ,给分析测定结果带来负误差 ,或由于与杂质共沉淀以及称量时沉淀吸水 ,引起正误差。又如滴定分析中 ,剂量点和滴定终点不完全符合等。 (2)仪器误差 :由仪器本身不够精密所产生 ,如天平、砝码和称量器皿本身不够准确 ,或没有根据实验的要求选择一定精密度的仪器等。 (3)试剂误差 :来源于试剂或蒸馏水所含微量杂质。 (4)个人操作误差 :由于每个分析工作者掌握操作规程、控制条件与使用仪器常有出入而造成。如不同操作者对滴定终点颜色变化的分辨判断能力有差异 ,个人视觉差异也常引起不正确读数。 2．减少系统误差常采取的对策 (1)标准物对照 :在任何测试中 ,甚至在使用标定仪器和基准试剂时 ,都应使用待测物质的标准溶液。这种做法能对方法的准确度提供一种有用的检查 ,因为测量所得数据必须落在真实值范围之内。标准溶液应与待测溶液用完全相同的方法处理 ,此时可以画出一条能够指示用浓度测量物质量变的标准曲线 ,从待测溶液得到的测定值应落在标准曲线范围之内 ,然后读出测定数值 ;或者取标准物某一确定浓度的溶液与待测液以同样的方法、在相同条件下平行测定 (标准物的组成最好与待测物相近 ,含量也相近 ),然后求平均值。 (2)设置试剂空白 :在任何测量实验中都应设置空白溶液作为对照 ,以消除由于试剂中含有干扰杂质或溶液对器皿的侵蚀等所产生的系统误差。用等体积的试剂代替待测液作为试剂空白液 ,并在相同条件下将试剂空白液、待测液和标准液严格按照相同方法处理后同时进行平行测定 ,所得结果称为试剂空白值。它是由所用的试剂而不是待测物所造成的。将待测物的分析结果扣除空白值 ,就可以得到比较准确的结果。 (3)校正仪器。 (二)偶然误差及减少的方法 偶然误差来源于某些难以预料的偶然因素 ,或是由于取样不随机 ,或是因为测定过程中某些不易控制的外界因素 (如测定时环境、温度、湿度和气压的微小波动 )的影响。同一实验者在同样条件下进行一系列测定时 ,每一次测量的结果都略有不同 ,这就是偶然误差。平均取样及多次取样进行平行测定 ,并计算平均值 ,可以有效地减少偶然误差。 第二章　生物化学实验基本操作 一、玻璃仪器的洗涤 　　生物化学实验所用玻璃仪器清洁与否 ,是获得准确结果的重要环节。因为玻璃仪器不清洁或被污染 ,会增大实验误差 ,得不到真实可靠的实验结果。因此 ,实验之前 ,将玻璃仪器清洗干净 (以倒置时管壁上不挂水珠为准 ),是非常重要的准备工作。 1． 一般玻璃仪器的洗涤　凡能用毛刷刷冲洗的仪器 (如试管、烧杯、量筒等 ),先用自来水冲洗 ,再用毛刷蘸取洗衣粉或去污粉将仪器内外 (特别是内壁 )仔细洗刷 ,用自来水冲洗干净后 ,再用蒸馏水荡洗 2 ~ 3次,倒置于仪器架上晾干备用。 2． 凡不能用毛刷刷洗的量器 (如刻度吸管、容量瓶等 ),应先用自来水冲洗、沥干 ,再用重铬酸钾清洁液浸泡 4 ~ 6小时 (或过夜)。从清洁液中取出并沥干后 ,用自来水冲洗干净 ,再用蒸馏水荡洗 2 ~ 3次,倒置于量器架上晾干备用。 3． 新购量器表面常附有游离的碱性物质及泥污 ,可先用洗衣粉洗刷再用自来水洗净 ,然后浸泡在 1% ~2%氯化氢溶液中过夜 (不少于 4小时 ),再进一步洗涤 ,最后再用蒸馏水荡洗 2 ~ 3次,倒置于仪器架上晾干备用。 二、吸量管的选择和使用 吸量管是生物化学实验中常用的量取液体的仪器 ,分为奥氏吸量管、移液管和刻度吸量管这 3种。我们常用到的吸量管是有不同规格 ,如10ml、5． 0ml、2． 0ml、1． 0ml、0． 5ml、 0． 25ml、0． 2ml、0． 1ml的刻度吸量管、奥式吸量管及移液管 ,可任意量取0．01 ~ 10ml的液体。其选择和使用方法如下。 1．选择 　使用前根据需要选择适当的吸量管 ,其总容量最好等于或稍大于取液量。临用前看清容量和刻度。 2．执管 　用右手拇指及中指 (辅以无名指 ),拿住吸量管的上部 ,用食指堵住管口控制液流 ,刻度数字要朝向操作者 ,切忌用大拇指堵住管口控制液流。 3．取液 　左手捏压洗耳球 ,手掌握住洗耳球的柄部 ,以免洗耳球在吸管上口滑动。将吸量管的尖端插入所取试剂液面下 ,将洗耳球的下端出口对准吸量管上口 ,将液体轻轻吸上,至最高刻度上端 1 ~ 2cm处,迅速用食指按紧管上口 ,使液体不会从管下口流出。 4．调准刻度 　将吸量管从溶液中取出后 ,如果是取黏性较大的液体 ,必须先用滤纸擦干管尖外壁 ,然后用食指控制液流使之缓慢下降至所需刻度 (此时液体弯月面底部、视线和刻度应在同一水平线上 ),右手食指立即按紧吸量管上口 ,使液体不

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